Publication details
Příprava enzymu nikotináthydroxylasy pro stanovení kyseliny nikotinové
| Title in English | Preparation of Nicotinic acid hydroxylase for determination of Nicotinic acid |
|---|---|
| Authors | |
| Year of publication | 2000 |
| Type | Article in Proceedings |
| Conference | Biochemie a molekulární biologie na prahu nového tisíciletí |
| MU Faculty or unit | |
| Citation | |
| Field | Biochemistry |
| Keywords | Nicotinic acid; Nicotinic acid hydroxylase; hypolipidemic activity |
| Description | Kyselina nikotinová-niacin (NA) kromě své známé vitaminové funkce hraje i velice důležitou roli v metabolismu lipidů. Jedním z důležitých terapeutických účinků kyseliny nikotinové je aktivní snižování hladiny celkového cholesterolu při současném zvyšování HDL v krevním séru. Léčba pomocí NA vede také k regresi ukládání cholesterolu do kůže a tím potlačení vzniku xantomů, potlačení vzniku lézí v koronárních artériích. Endogenní kyselina nikotinová je převáděna na nikotinamid (NAm), který je odbouráván na N-methylnikotinamid a dále je oxidován na pyridon. Vitamínově aktivním metabolitem je pouze NAm, který však nemá hypolipidemickou aktivitu. NA jako léčivo má však i řadu vedlejších účinků jako např: dráždění žaludku, bolesti hlavy, nausea, diarhea, kožní vasodilatace, zarudnutí a svědění pokožky. Z výše zmíněných údajů je zřejmá důležitost monitorování průběhu léčby kyselinou nikotinovou. K tomuto účelu je třeba vysoce citlivá a selektivní metoda stanovení. Mezi využívané metody patří např: chromatografické techniky, chemické či mikrobiologické metody, pouze některé jsou však schopné detekovat fyziologickou koncentraci NA v plasmě a většinou se příliš nehodí pro rutinní stanovení. V klinické praxi je běžné stanovovat řadu látek enzymaticky. Proto byly hledány enzymy vhodné pro enzymatické stanovení NA a pro další využití byl zvolen enzym katalyzující hydroxylaci kyseliny nikotinové nikotináthydroxylasa (NAH). Jedná se o mikrobiální enzym vyskytující se jak anaerobů např: Clostridium barkeri tak u aerobních bakterií např: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis. Prezentovaná práce byla zaměřena na kultivaci obou bakteriálních kmenů, purifikaci a charakterizaci enzymu NAH z Pseudomonas fluorescens, pro jeho následné využití ke stanovení NA. NAH snáší krátkodobé působení vyžších teplot (75C). Při purifikacích mezi jednotlivými kroky je lépe uchovávat enzym při teplotě 4C, pro dlouhodobější skladování je vhodnější uchovávat NAH při -60C s nepříliš častým opětovným zmrazováním a rozmrazováním. Ze závislosti aktivity na pH lze usuzovat na pH optimum 7.05, kdežto dlouhodobě stabilní je enzym spíše v kyselé oblasti pH, kde byl také nalezen i jeho izoelektrický bod. Enzym NAH z Ps. fluorescens je patrně dosti velká molekula s relativní molekulovou hmotností přibližně 300 000, která se skládá z více podjednotek, jejichž disociace závisí na podmínkách a může být reversibilní. Bližší chování podjednotek NAH bylo testováno metodou titračních křivek. K vlastnímu stanovení NA lze použít již částečně přečištěný enzymový preparát po ionexové chromatografii. Nikotinamid jako strukturně podobný analog kyseliny nikotinové, běžně se v séru vyskytující, při jejím stanovení neinterferuje. |