Publication details
Srovnání tří metod stanovení lysozymu v hemolymfě hmyzu
| Authors | |
|---|---|
| Year of publication | 2006 |
| Type | Article in Proceedings |
| Conference | Zoologické dny Brno 2006 |
| MU Faculty or unit | |
| Citation | |
| Keywords | lysozyme; zone diffusion assay; hemolymph; insect |
| Description | Lysozym je součástí humorální složky přirozené imunity hmyzu stejně tak jako jiných bezobratlých a obratlovců. Řadíme ho mezi antibakteriální proteiny hemolymfy, které se nacházejí běžně v hemolymfě (stejně jako fenoloxidázy ve formě profenoloxidáz, lektiny, hemolin, aglutininy). Lysozym katalyzuje hydrolýzu polysacharidových řetězců G+ bakterií (lytický, baktericidní faktor pro G+ bakterie, bakteriostatický faktor pro G- bakterie). U hmyzu se vyskytuje ve všech tkáních a jeho aktivita (koncentrace) v hemolymfě stoupá po injikaci antigenu i po poranění. Cílem práce bylo porovnat tři metody stanovení lysozymu na základě kalibračních křivek (lysozym E.C. 3.2.1.17; Sigma; 2, 5, 10, 15 a 20 mg/ml). Dále byla použita hemolymfa B. mori a G. mellonella. Všechny metody využívají bakterii Micrococcus luteus, která je nejcitlivější na působení lysozymu. Koncentraci lysozymu lze stanovit radiální difúzí v agaróze. Průměr difúzní zóny je přímo úměrný bakteriolytické aktivitě vzorku a po přepočtu podle kalibrační křivky je množství lysozymu vyjádřeno v mg/ml hemolymfy. Dále byla použita SDS-PAGGE (polyakrylamidová gradientová gelová elektroforéza v prostředí dodecylsulfátu sodného). Gely obarvené stříbrem byly analyzovány na videodensitometru v programu Molecular Analyst. Kalibrační křivka byla sestrojena na základě množstevní (kvantitativní) analýzy detekovaných frakcí, molekulová hmotnost 14,5 kDa byla ověřena porovnáním se standardem molekulových hmotností. Turbidimetrická metoda stanovuje aktivitu lysozymu jako pokles absorbance vzorku při 530 nm po 10 minutách inkubace. Elektroforetické stanovení lysozymu je časově velmi náročné a dochází při něm k přebarvení ostatních proteinových frakcí. Turbidimetrická metoda se nejeví jako spolehlivá, protože změna absorbance není jednoznačně úměrná koncentraci lysozymu. Nejlépe se osvědčila metoda radiální difúze v agaróze, protože je velmi rychlá, levná, citlivá a použitelná nejen pro vzorky hmyzí hemolymfy a tkání, ale i pro jiné vzorky obsahující lysozym. |